Transduction pour étiqueter les cellules tumorales PDX : Introduction du lentivirus exprimant le marqueur fluorescent dans la cellule tumorale in vitro

Le lentivirus est un rétrovirus qui contient du matériel génétique ARN. Ce virus fournit une méthode efficace et stable d’introduction de transgènes dans les lignées cellulaires cancéreuses. Commencez par ajouter de la neuraminidase à un tube contenant du lentivirus qui exprime des protéines fluorescentes vertes, ou GFP. Gardez le tube à 37 degrés Celsius pendant une heure pour augmenter l’efficacité de liaison du virus.

Ensuite, centrifugeuse un tube contenant la suspension cellulaire tumorale pour former une pastille. Ajouter des supports de mammosphère contenant du polybrene pour résuspendre les cellules. Le polybrene est un polymère cationique qui augmente l’efficacité de l’infection lentivirale. Maintenant plaque le nombre optimal de cellules tumorales par puits dans une plaque de culture de six tissus bien. Ajouter la quantité requise de Lentivirus dans chaque puits de la plaque de culture.

Faites tourbillonner la plaque pour mélanger le contenu et maintenez-la à 37 degrés Celsius pendant 96 heures avec un approvisionnement continu en dioxyde de carbone. Le Lentivirus pénètre dans la cellule et libère de l’ARN. La transcriptase inverse virale convertit l’ARN en ADN double brin qui s’intègre dans le génome hôte. Placez la plaque sous un microscope fluorescent et surveillez les cellules pour une transduction réussie. Les cellules transduced fluoresce en raison de l’expression GFP.

Dans le protocole d’exemple, nous effectuerons la transduction des cellules tumorales PDX-dissociées avec des vecteurs Lentiviral.

Pour traduire les cellules tumorales, centrifugez les cellules isolées pour la résuspension en deux millilitres de milieu de mammosphère. Après comptage, centrifuger les cellules à nouveau et résuspendre la pastille en deux millilitres de milieu de mammosphère, complétée par 20 microlitres de polybrene. Ensuite, plaque 2 fois 10 à la cinquième cellules tumorales viables par puits dans une ultra faible adhérence six plaque de culture de tissu de puits et particules lentivirales aux cellules à une multiplicité d’infection de 10.

Faites tourbillonner la plaque pour mélanger le virus avec les cellules et incuber les co-cultures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant jusqu’à 96 heures, en ajoutant 500 microlitres de milieu de mammosphère fraîche après les 24 premières heures. Lorsqu’au moins 10 % des cellules sont positives au GFP, transférez les cellules transduced d’au moins un puits dans un tube conique de 15 millilitres sur la glace et lavez le puits avec un millilitre de milieu de mammosphère.

Mettre le lavage en commun avec les cellules et centrifugeuses les cellules tumorales en 10 millilitres de HBSS plus HEPES. Enfin, resuspendez les cellules dans 50 microlitres d’extrait de matrice de sous-sol sur la glace et chargez les cellules incorporées dans une seringue d’insuline de 0,5 millilitre pour la réimplantation.