Summary
Presentamos un método automatizado para caracterizar el módulo elástico efectivo de una lente ocular mediante una prueba de compresión.
Abstract
Las propiedades biomecánicas de la lente ocular son esenciales para su función como elemento óptico de potencia variable. Estas propiedades cambian drásticamente con la edad en el cristalino humano, lo que resulta en una pérdida de la visión de cerca llamada presbicia. Sin embargo, los mecanismos de estos cambios siguen siendo desconocidos. La compresión de la lente ofrece un método relativamente simple para evaluar la rigidez biomecánica de la lente en un sentido cualitativo y, cuando se combina con técnicas analíticas adecuadas, puede ayudar a cuantificar las propiedades biomecánicas. Hasta la fecha, se han realizado una variedad de pruebas de compresión de lentes, incluidas las manuales y automatizadas, pero estos métodos aplican de manera inconsistente aspectos clave de las pruebas biomecánicas, como el preacondicionamiento, las tasas de carga y el tiempo entre mediciones. Este artículo describe una prueba de compresión de lente totalmente automatizada en la que una platina motorizada se sincroniza con una cámara para capturar la fuerza, el desplazamiento y la forma de la lente a través de un protocolo de carga preprogramado. A partir de estos datos se puede calcular un módulo elástico característico. Si bien se demuestra aquí utilizando lentes porcinas, el enfoque es apropiado para la compresión de lentes de cualquier especie.
Introduction
El cristalino es el órgano transparente y flexible que se encuentra en el ojo y que le permite enfocar a diferentes distancias cambiando su poder de refracción. Esta habilidad se conoce como acomodación. El poder refractivo se ve alterado debido a la contracción y relajación del músculo ciliar. Cuando el músculo ciliar se contrae, el cristalino se engrosa y se desplaza hacia adelante, aumentando su poder refractivo 1,2. El aumento de la potencia de refracción permite que la lente enfoque los objetos cercanos. A medida que los humanos envejecen, el cristalino se vuelve más rígido y esta capacidad de acomodación se pierde gradualmente; Esta afección se conoce como presbicia. El mecanismo de endurecimiento sigue siendo desconocido, al menos en parte debido a las dificultades asociadas con la caracterización biomecánica de la lente.
Se han empleado diversos métodos para estimar la rigidez y las propiedades biomecánicas del cristalino. Estos incluyen la rotación de lentes 3,4,5, los métodos acústicos 6,7,8, los métodos ópticos como la microscopía de Brillouin9, la indentación 10,11 y la compresión12,13. La compresión es la técnica experimental más accesible, ya que se puede realizar con instrumentación simple (por ejemplo, cubreobjetosde vidrio 14,15) o con una sola platina motorizada. Anteriormente hemos mostrado cómo las propiedades biomecánicas de la lente pueden estimarse rigurosamente a partir de una prueba de compresión16. Este proceso es técnicamente desafiante y requiere un software especializado al que no pueden acceder fácilmente los investigadores de lentes interesados en las mediciones de rigidez relativa. Por lo tanto, en el presente estudio, nos centramos en métodos accesibles para estimar el módulo elástico de la lente teniendo en cuenta el tamaño de la lente. El módulo elástico es una propiedad intrínseca del material relacionada con su deformabilidad: un módulo elástico alto corresponde a un material más rígido.
La prueba en sí es una prueba de compresión de placas paralelas y, por lo tanto, se puede realizar en sistemas de prueba mecánicos comerciales adecuados. Aquí, se construyó un instrumento personalizado compuesto por un motor, una etapa lineal, un controlador de movimiento, una célula de carga y un amplificador. Estos se controlaban mediante un software personalizado que también registraba el tiempo, la posición y la carga a intervalos regulares. Las lentes de cerdo no se adaptan, pero son de fácil acceso y económicas17. Se desarrolló el siguiente método para comprimir gradualmente el cristalino del ojo y cuantificar su módulo elástico. Este método se puede replicar fácilmente y será útil en el estudio de la rigidez de la lente.
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Protocol
Los ojos de cerdo se obtuvieron de un matadero local. No se requirió la aprobación del comité de ética.
1. Disección del cristalino (Figura 1)
- Retire todo el tejido circundante de los ojos de cerdo y el exceso de carne de la esclerótica, hasta que solo quede el nervio óptico. Usa pinzas curvas y tijeras de disección pequeñas para completar este proceso. Use el nervio como un ancla para sostener el ojo durante la disección.
- Con un bisturí, haz un corte circunferencial corto en el limbo y luego otro en el ecuador.
NOTA: Este paso se realiza en este orden para evitar dañar la lente y la cápsula. - Inserte unas microtijeras en el corte en el limbo y retire la córnea levantando la córnea con unas pinzas finas de punta roma mientras corta alrededor de la circunferencia de la córnea.
- Retire el iris levantándolo con pinzas de punta roma y córtelo con unas microtijeras.
- Inserte las tijeras de disección en el corte ecuatorial, luego corte circunferencialmente alrededor de todo el ecuador hasta que la esclerótica esté dividida.
- Una vez completado el corte, retire la parte posterior de la esclerótica. Retire el vítreo suavemente con pinzas, dejando restos mínimos para evitar dañar la lente. Si es necesario, corte el humor vítreo coronalmente para permitir que la parte posterior se separe del cristalino y del segmento anterior.
- Haz un corte meridional a través de la esclerótica de anterior a posterior con unas tijeras.
- Comenzando en el nuevo corte meridional a través de la esclerótica, use microtijeras para cortar las zonules lejos de la lente. Usando el peso de la lente o el borde de la placa de disección, estire suavemente las zonulas al separar ligeramente la lente y la esclerótica, permitiendo que las microtijeras corten entre la lente y el cuerpo ciliar, a través de las zonulas y alrededor de la circunferencia de la lente. Esto aislará la lente sin dañar la cápsula de la lente si se hace correctamente.
- Si lo desea, retire la cápsula con pinzas para perforar la cápsula en su ecuador, luego retire la cápsula con dos pinzas.
- Coloque la lente en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Inspeccione visualmente la lente en busca de daños antes de realizar pruebas mecánicas.
2. Compresión de la lente con/sin cápsula de la lente (Figura 2)
NOTA: Todos los pasos aquí, con la excepción de los pasos 2.1 y 2.4, están controlados por computadora.
- Obtener o construir un aparato de compresión de placas paralelas que tenga una célula de carga con una capacidad de 50 gramos de fuerza con la capacidad de medir el desplazamiento del orden de 1 μm.
- Programe la etapa motorizada y cargue la celda para realizar el régimen de carga que se describe a continuación (por ejemplo, Archivo Suplementario 1).
- Casi llene una caja cuadrada de 1 5/8 pulgadas x 1 5/8 pulgadas con PBS y colóquela en la plataforma de compresión.
- Baje la placa superior en contacto con la placa inferior para determinar el límite inferior de movimiento y la altura absoluta del espacio.
- Levante la placa superior ~15 mm.
- Centre la lente en la caja, cuidando que el plano ecuatorial sea horizontal.
- Baje la placa superior cerca de la superficie superior de la lente, pero no en contacto con ella.
- Inicie el movimiento para mover la placa superior en contacto con la lente, utilizando la retroalimentación de fuerza con un umbral de contacto de 3 mN.
- Comience el registro de datos una vez determinado el contacto, el tiempo de registro, la posición de la placa superior en relación con la placa inferior y la fuerza a 500 Hz.
- Aplique una carga de preacondicionamiento en la que la lente se comprime en un 2,5 % de su altura inicial tres veces, luego en un 5 % tres veces, luego en un 7,5 % tres veces a una velocidad de 1 % / s.
- Mantenga constante la posición de la placa superior durante 1 minuto después del preacondicionamiento.
- Aplique una compresión del 15% a una velocidad del 1%/s, seguida de la descarga a la misma velocidad.
- Continúe el movimiento de descarga hasta que la placa superior haya recorrido un 2% adicional del grosor de la lente descargada lejos de la placa inferior para asegurarse de que la lente se desadhiera de la placa superior.
3. Estimación del módulo de la lente
- Calcule el grosor de la lente en función del espacio del instrumento en el punto de contacto. Alternativamente, utilice el análisis de imágenes para medir el grosor de una fotografía tomada antes de la prueba.
- Calcule el módulo elástico E usando el modelo de Hertz para la compresión de una esfera entre placas paralelas (ecuación [1]; Expediente Complementario 2).
(1)
Donde R es el radio de curvatura en el punto de contacto (se supone que es igual a la mitad del grosor de la lente); F es la fuerza de compresión informada por la célula de carga;
es la relación de Poisson (se supone igual a 0,5 correspondiente a un material incompresible); y u es la aproximación descendente de la etapa superior desde el punto de contacto. Tenga en cuenta que el módulo elástico y la relación de Poisson son propiedades del material que indican, respectivamente, la rigidez intrínseca de la lente y la compresibilidad relativa de la lente.
NOTA: Este método descuida cualquier función de la cápsula de la lente, pero tiene en cuenta aproximadamente el tamaño de la lente, lo que permite la comparación entre especies.
(1)
es la relación de Poisson (se supone igual a 0,5 correspondiente a un material incompresible); y u es la aproximación descendente de la etapa superior desde el punto de contacto. Tenga en cuenta que el módulo elástico y la relación de Poisson son propiedades del material que indican, respectivamente, la rigidez intrínseca de la lente y la compresibilidad relativa de la lente.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Se comprimieron seis lentes porcinas, primero con la cápsula intacta y luego después de una cuidadosa extracción de la cápsula. Los valores de espesor fueron de 7,65 ± 0,43 mm para las lentes encapsuladas y de 6,69 ± 0,29 mm para las lentes desencapsuladas (media ± desviación estándar). En la Figura 3 se muestra un historial de carga típico. Las curvas de fuerza-desplazamiento resultantes estaban bien ajustadas por el modelo de Hertz (es decir, tenían una fuerza proporcional al desplazamiento elevado a la potencia de 1,5; Figura 4). Esto fue cierto tanto para las lentes encapsuladas como para las desencapsuladas.
Las lentes se comprimieron primero en un 15% de su espesor descargado con una cápsula intacta, y luego después de retirar la cápsula. Se ha demostrado previamente que la compresión axial en un 15% del espesor inicial no causa daño a las suturas del cristalino18. La desencapsulación resultó en una disminución significativa en el módulo elástico efectivo (n = 6; p = 0,0138; Figura 5).
Figura 1: Técnica de disección. (A) Se extirpan los tejidos extraoculares. (B) Se hace un corte circunferencial en el limbo. (C) Se realiza un corte circunferencial en el ecuador. (D) Se extirpa la córnea. (E) Se retira el iris. (F) El ojo se divide en dos en el ecuador, luego (G) se elimina el vítreo, dejando (H) un anillo anular que contiene el cristalino, el cuerpo ciliar y las zónulas aún unidas a la esclerótica. (I) Se realiza un corte meridional a través de la esclerótica para (J) dar acceso a las zonulas, (K) que se cortan dejando (L) el cristalino encapsulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aparato de ensayo de compresión. (A) Esquema y (B) fotografía del aparato de compresión de la lente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Historial de carga aplicado para una lente porcina encapsulada. Arriba: Historial de desplazamientos. Abajo: Historial de la fuerza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Datos típicos de fuerza-desplazamiento ajustados con el modelo de Hertz. Izquierda: Datos de una lente porcina encapsulada. Derecha: Datos de compresión para la misma lente después de la desencapsulación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Diagrama de caja y bigotes de módulos elásticos efectivos de lentes porcinos encapsulados y desencapsulados. El módulo efectivo de las lentes encapsuladas fue significativamente mayor que el de las lentes desencapsuladas (p = 0,013), lo que indica que la presencia de la cápsula puede alterar sustancialmente la rigidez efectiva de la lente. Los datos corresponden a seis lentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Aplicación de MATLAB para controlar el aparato de compresión de lentes. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 2: Función de MATLAB para estimar el módulo elástico a partir de datos de compresión de fuerza. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La compresión de la lente es un método versátil para estimar la rigidez de la lente. Los procedimientos descritos anteriormente permiten la comparación entre lentes de diferentes especies y diferentes tamaños. Todas las deformaciones se normalizan en función del tamaño de la lente, y el cálculo del módulo elástico tiene en cuenta aproximadamente el tamaño de la lente. El módulo efectivo es considerablemente más alto que el módulo reportado previamente para la lente porcina 4,7,11,19, al menos en parte debido al uso del grosor en lugar del radio de curvatura: los radios polares de curvatura de la lente porcina son significativamente mayores que la mitad del grosor 20.
El análisis simple (es decir, el uso del modelo de Hertz) presentado aquí tiene varias limitaciones clave. En primer lugar, no tiene en cuenta la presencia de la cápsula del cristalino. Se ha demostrado que la presencia de la cápsula puede alterar significativamente las propiedades biomecánicas del cristalino 16,21. Por lo tanto, este método se aplica mejor a las lentes desencapsuladas. Esto es particularmente importante cuando se comparan especies en los casos en que la cápsula puede tener espesores o propiedades biomecánicas significativamente diferentes. Este método también supone que la lente es mecánicamente homogénea; Nosotros y otros hemos demostrado previamente que este no es generalmente el caso de las lentes porcinas o humanas 4,5,6,10,11,22. Por lo tanto, es mejor considerar el valor del módulo elástico calculado como un módulo efectivo, que presumiblemente está relacionado con el promedio volumétrico del módulo que varía espacialmente dentro de la lente. El modelo de Hertz asume que la lente es linealmente elástica, mientras que se sabe que es viscoelástica; Por lo tanto, el análisis simple que aquí se propone es incapaz de proporcionar información sobre la viscoelasticidad del cristalino. Trabajos anteriores también han demostrado que el método y la duración del almacenamiento de las lentes antes de las pruebas pueden alterar las propiedades de las lentes4; Por lo tanto, todas las lentes porcinas se probaron inmediatamente después de la disección a su llegada al laboratorio.
La diferencia en las mediciones de fuerza-desplazamiento se debe al ruido del amplificador de la célula de carga: la extracción de la cápsula hace que las mediciones de fuerza sean considerablemente más bajas y, por lo tanto, la relación señal-ruido es menor. Los supuestos utilizados para derivar el modelo de Hertz incluyen de manera importante que la esfera es un material homogéneo; Por lo tanto, el módulo elástico efectivo está promediando de alguna manera la deformabilidad de la lente y su cápsula cuando la cápsula está presente. Esto hace que las comparaciones entre especies y edades sean particularmente difíciles porque una lente porcina tiene una cápsula de ~60 μm de grosor, mientras que una lente de ratón o humana tiene una cápsula en el rango de 5-15 μm de grosor. El módulo elástico de la cápsula también puede variar con la especie y la edad, aunque estas dependencias son desconocidas. Por lo tanto, si bien es posible obtener un ajuste menos ruidoso con la cápsula, la comparación se confunde inherentemente por la presencia de la cápsula, esta es la razón por la que recomendamos realizar la prueba sin la cápsula.
Finalmente, se calculó el módulo efectivo asumiendo que el radio de curvatura era la mitad del grosor de la lente. Esto es cierto solo para una lente esférica; La lente porcina es significativamente asférica y, por lo tanto, los valores efectivos del módulo son considerablemente más altos de lo que serían si se utilizara el radio de curvatura en su lugar. Esta última suposición se puede superar midiendo los radios de curvatura, aunque esto puede ser complicado para la superficie inferior, que siempre es plana debido al contacto con la placa inferior. También es menos importante para las lentes más esféricas, como las lentes murinas. Mejor aún es el uso del análisis de elementos finitos inversos para determinar las propiedades mecánicas de la lente16.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Con el apoyo de la subvención R01 de los Institutos Nacionales de Salud EY035278(MR, por sus siglas en inglés).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisherbrand | 16-100-110 | |
| Galil COM Libraries | Galil Motion Control | ||
| High Precision Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-164 | |
| Linear Stage | McMaster-Carr | 6734K4 0.125" | |
| Load Cell | FUTEK | LSB200-FSH03869 | |
| Load Cell Amplifier | FUTEK | IAA300-FSH03931 | |
| MATLAB | The Mathworks, Inc. | ||
| Microprobe | Surgical Design | 22-079-740 | |
| Miniature Self Opening Precision Scissors | Excelta | 63042-004 | |
| Motion Controller | Galil Motion Control | DMC-31012 | |
| Motor | Galil Motion Control | BLM-N23-50-1000-B | |
| Straight Hemastats | Fine Science | NC9247203 | stainless steel, 14cm |
References
- Gullstrand, A. Helmholtz's treatise on physiological optics. translated edn. The Optical Society of America. , Rochester, N.Y. (1924).
- Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthalmol. 1, 1-74 (1855).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Reilly, M. A., Martius, P., Kumar, S., Burd, H. J., Stachs, O. The mechanical response of the porcine lens to a spinning test. Z Med Phys. 26 (2), 127-135 (2016).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Spatially mapping the elastic properties of the lens using bubble-based acoustic radiation force. IEEE Ultrasonics Symp. 1, 613-616 (2005).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Mapping age-related elasticity changes in porcine lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 84 (2), 332-341 (2007).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. A high pulse repetition frequency ultrasound system for the ex vivo measurement of mechanical properties of crystalline lenses with laser-induced microbubbles interrogated by acoustic radiation force. Phys Med Biol. 57 (15), 4871-4884 (2012).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Weeber, H. A., Gabriele, E., Wolfgang, P.
- Reilly, M. A., Ravi, N. Microindentation of the young porcine ocular lens. J Biomech Eng. 131 (4), 044502 (2009).
- Gu, S., et al. Connexin 50 and AQP0 are essential in maintaining organization and integrity of lens fibers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (12), 4021-4032 (2019).
- Sharma, P. K., Busscher, H. J., Terwee, T., Koopmans, S. A., van Kooten, T. G. A comparative study on the viscoelastic properties of human and animal lenses. Exp Eye Res. 93 (5), 681-688 (2011).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Baradia, H., Negin, N., Adrian, G.
- Reilly, M. A., Cleaver, A. Inverse elastographic method for analyzing the ocular lens compression test. J Innov Opt Health Sci. 10 (06), 1742009 (2017).
- Hahn, J., et al. Measurement of ex vivo porcine lens shape during simulated accommodation, before and after fs-laser treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. The mechanical properties of ex vivo bovine and porcine crystalline lenses: age-related changes and location-dependent variations. Ultrasound Med Biol. 39 (6), 1120-1127 (2013).
- Reilly, M. A., Hamilton, P., Gavin, P., Nathan, R. Comparison of the behavior of natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88 (3), 483-494 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Wilde, G. S., Burd, H. J., Judge, S. J. Shear modulus data for the human lens determined from a spinning lens test. Exp Eye Res. 97 (1), 36-48 (2012).
